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蛋白质磷酸化位点鉴定和定量分析

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  (1)背景介绍
  蛋白质磷酸化修饰是生物体内普遍存在的调节机制,虽然细胞内约有30%的蛋白能发生磷酸化,但磷酸化修饰是一个动态过程,在特定时间及特定刺激条件下,细胞内磷酸化蛋白只占总量的1%-2%,并且对磷酸化修饰来说,其本身是一个可逆的过程,磷酸化修饰与去磷酸化修饰的转换十分快速。因此,磷酸化富集技术对于磷酸化蛋白质组学的研究尤为关键。目前,基于IMAC和TiO2的磷酸化肽段富集技术,结合高通量液相色谱质谱联用技术,成为高通量定性和定量研究蛋白质磷酸化修饰的最有效手段。
 
  (2)实验流程
 
 
  (3)案例分析
  a.目的
  SeV感染宿主细胞后,会激活抗病毒天然免疫信号通路。本研究中,我们结合SILAC标记,IMAC富集,以及HILIC色谱分离和高通量质谱检测,对SeV感染的293T细胞进行磷酸化蛋白质组学分析。找出受SeV刺激调控的磷酸化位点,为天然免疫研究提供新线索。
 
  b.步骤
 
 
  c.结果
  为保证数据准确性,进行了三次生物学重复,一共鉴定到5677个磷酸化肽段,其中4380个磷酸化肽段被定量到。根据皮尔森相关性分析,发现实验重复性好,数据可靠性高。随后对发生变化的蛋白磷酸化位点进行了一系列生物信息学分析,结果如下:
 
 
  (4)参考文献
  ● The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nature Protocols 2008.
 
  ● High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology 2015.
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