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蛋白质组学

溶液内蛋白质鉴定

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  (1)背景介绍
  溶液内蛋白质鉴定的基本流程与胶内蛋白质鉴定类似,主要区别在于:(1)溶液内蛋白质样品处理方法有别于胶内样品;(2)溶液内蛋白成分较单一蛋白条带相对复杂,需采用较长的梯度进行质谱数据采集。
  根据项目的不同,样品可能是复杂的全细胞裂解液,或者IP的洗脱液,或者蛋白纯化产物,通过质谱检测,可以得到样品中蛋白成分的鉴定结果,并可根据特定需求,提供相对定量参考或蛋白功能注释等分析。
 
  (2)实验流程
 
 
  (3)案例分析
  a.目的
  鉴定与靶标蛋白DDX58相互作用的蛋白质。为了实现这一目标,选取两种细胞系(一种为稳定表达带HA标签DDX58蛋白的293细胞系,命名为实验组T;另一种为常规293细胞系,命名为对照组C),用HA抗体分别免疫共沉淀实验组T及对照组C,收集蛋白洗脱液,溶液内酶解后,通过质谱分析,排除非特异性结合蛋白,最终筛选出与DDX58相互作用的蛋白。
 
  b.步骤
  1)免疫共沉淀纯化靶标蛋白及相互作用蛋白;
  2)从洗脱液中进行蛋白提取;
  3)溶液内蛋白酶解;
  4)质谱检测;
  5)数据库检索并鉴定蛋白。
 
  c.结果
  在实验组T和对照组C中鉴定到的蛋白可以分为两大类:一类是在T组含量比在C组多的蛋白,另一类则是含量相当或在C组更多的蛋白。根据实验目的,需要关注的蛋白是第一类,作为互作的候选蛋白。部分鉴定结果如下表所示,靶标蛋白DDX58只在实验组T中被检测到,ACTN4、SFPQ、SND1则可能是DDX58的相互作用蛋白。基于蛋白质丰度越高,采集到的二级谱图数越多的原则,我们采用谱图计数方法进行蛋白含量相对比较,结果见下表:
 
  质谱鉴定蛋白列表
 
#
Accession
Name
MS2 count (T)
MS2 count (C)
1
O95786
DDX58
85
0
2
P13639
EF2
52
51
3
Q00839
HNRPU
44
40
4
P11586
C1TC
39
43
5
P08238
HS90B
33
31
6
P14625
ENPL
29
21
7
Q8WUM4
PDC6I
25
27
8
O43707
ACTN4
22
0
9
P23246
SFPQ
23
3
10
Q7KZF4
SND1
18
1
11
Q9BUJ2
HNRL1
2
3
12
P35527
K1C9
0
2
 
  (4)参考文献
  ● A Chemical Proteomics Approach to Profiling the ATP-binding Proteome of Mycobacterium tuberculosis. Molecular & Cellular Proteomics 2013.
 
  ● Systematic Analysis of Human Protein Complexes Identifies Chromosome Segregation Proteins. Science 2010.
 
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