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蛋白质组学

胶内蛋白质鉴定

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  (1)背景介绍
  在蛋白质组学技术出现之前,蛋白质鉴定是比较困难的。基于质谱的蛋白质组学技术出现之后,蛋白质的鉴定才变得简单、常规。SDS-PAGE电泳得到的条带,如果想要鉴定蛋白,或者确认是否为目的蛋白,都可以通过质谱方法得以实现。此外,蛋白的翻译后修饰位点(如磷酸化、乙酰化、泛素化等)也可以通过该方法进行检测。
  蛋白样品经过胶内酶解为肽段后,通过电喷雾进入质谱、碎裂后,扫描得到二级质谱图,通过数据库检索就可以得到蛋白的鉴定信息和得分情况。
 
  (2)实验流程
 
 
  (3)案例分析
  a.目的
  鉴定实验组与对照组的差异蛋白条带。实验组与对照组相比,在高分子量区出现了一个明显的差异蛋白条带(见下图),通过切取目的条带、胶内酶解、质谱检测的方法来鉴定该未知蛋白。
 
 
  b.步骤
  1)SDS-PAGE分离蛋白;
  2)切取目的条带(方框所示);
  3)胶内酶解蛋白并抽提肽段;
  4)质谱检测;
  5)数据库搜索并鉴定蛋白。
 
  c.结果
  通过质谱分析,共鉴定到15个蛋白,排名前五的蛋白如下表所示。排名第一的蛋白匹配到57个肽段,远远大于其余蛋白,且PAGE胶中该蛋白的分子量也与理论值一致。因此,判断该条带的主蛋白是D05D44,其中一个肽段的二级质谱图见下图:
 
  质谱鉴定蛋白列表
 
#
Accession
Gene
MW.
Peptide #
1
Q05D44
Eif5b
137.6kD
57
2
P62889
Rpl30
12.7kD
6
3
Q6P542
Abcf1
94.9kD
5
4
Q61584
Fxr1
76.2kD
3
5
E9Q9T8
Mybpc3
141.3kD
1
 
  肽段的二级质谱图
 
 
  参考文献
  ● In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols 2006.
  ● A proteomic analysis of ataxia telangiectasia-mutated (ATM)/ATM-Rad3-related (ATR) substrates identifies the ubiquitin-proteasome system as a regulator for DNA damage checkpoints. The Journal of Biological Chemistry 2007.
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